多重PCR_SNP檢測
技術(shù)簡介
多重PCR_SNP檢測是一種將多重PCR和高通量測序相結(jié)合的高效SNP檢測技術(shù)。通過對多個(gè)待檢位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用多重 PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，即可一次性擴(kuò)增出所有待檢位點(diǎn)序列，繼而結(jié)合高通量測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)對大樣本多位點(diǎn) SNP 的檢測。
檢測原理
濃度 (Qubit) | 體積 | 總量 | DNA 片段 |
≥40 ng/μL | ≥20 μL | ≥0.8 μg | DNA 無降解 |
注：SNP位點(diǎn)數(shù)＞50個(gè)，每增加50個(gè)位點(diǎn)，體積增加10uL。
技術(shù)參數(shù)
多重PCR_SNP檢測 （30<SNP位點(diǎn)<200） | 測序策略 | 數(shù)據(jù)量 | 周期 | 檢出率 |
HiSeq/NovaSeq PE150 | 1000X | 65個(gè)自然日 | 95% |
（1）適用性廣：該技術(shù)適用于所有有參物種的 SNP 檢測。
（2）靈敏度高：應(yīng)用高通量的方法可完成對SNP位點(diǎn)及其周圍序列的測定。
（3）通量高：將多重 PCR 與高通量測序相結(jié)合，運(yùn)用 Illumina 測序平臺(tái)，一次可以完成3000個(gè)樣本200個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測。
（4）成本低：對于大樣本、多位點(diǎn)SNP的檢測，多重PCR_SNP基因分型檢測的成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 Sanger檢測。
（5）準(zhǔn)確率高：HiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量深度測序，測序深度可達(dá)上萬 X，檢出率達(dá) 95%以上，檢測準(zhǔn)確率可達(dá)到 98%以上。
案例分析
基于多重PCR擴(kuò)增子目標(biāo)測序進(jìn)行SNP基因分型[1]
研究背景
新一代測序（NGS）技術(shù)使基因組重新測序能夠在個(gè)體間探索全基因組多態(tài)性，以及靶向重新測序，以快速和同時(shí)檢測與各種生物功能相關(guān)的基因中的多態(tài)性。因此，用于靶向重測序的簡單且穩(wěn)健的方法應(yīng)促進(jìn)廣泛的生物學(xué)領(lǐng)域中的基因分型。
研究方法
檢測來自8個(gè)親本種質(zhì)的443個(gè)擴(kuò)增子以及Bd21和Bd3-1雜交得到的F 1子代的SNP進(jìn)行基因分型。
研究結(jié)果
結(jié)果表明通過對模型草Brachypodium distachyon進(jìn)行基因分型，SNP的檢測率能達(dá)到95％。評估表明該方法為準(zhǔn)確和穩(wěn)健的SNP基因分型提供了有效的框架。
圖1 B. distachyon的8個(gè)自然種質(zhì)中各個(gè)染色體上的SNPs的鑒定和選擇概況
參考文獻(xiàn)
Onda Y, Takahagi K, Shimizu M, et al. Multiplex PCR Targeted Amplicon Sequencing (MTA-Seq): Simple, Flexible, and Versatile SNP Genotyping by Highly Multiplexed PCR Amplicon Sequencing[J]. Front Plant Sci. 2018, 9(201):1-10.
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